PROYECTO GENOMA HUMANO

¿CÓMO SE SECUENCIA?


INTRODUCCIÓN

Estudiar el genoma humano (el conjunto completo de todos nuestros genes), es una forma de estudiar los detalles más fundamentales sobre nosotros mismos. Un alfabeto de cuatro letras conforma los tres mil millones de pares de bases que forman la secuencia de DNA, dividida en 23 pares de cromosomas situados en el núcleo de nuestras células. Por supuesto, las personas no son idénticas, por lo que las secuencias de DNA difieren sutilmente entre cada individuo. El Proyecto Genoma Humano está produciendo una secuencia significativa.
Esta secuencia representativa es una composición de varias personas que donaron muestras de sangre. Cerca de 100 personas se ofrecieron voluntariamente, firmando su consentimiento del uso de su sangre para estudios de DNA, permaneciendo en el anonimato la secuencia de DNA usada.
El proyecto tiene como objetivo leer, letra a letra, las tres mil millones de unidades que forman el DNA. Los científicos del proyecto comenzaron la secuenciación a gran escala del DNA en 1999. Antes de empezar a secuenciar el genoma, elaboraron mapas de los cromosomas humanos y desarrollaron y refinaron técnicas para el análisis del DNA. Con las herramientas en mano, los científicos tardaron apenas un año para amontonar la secuencia que cubría más del 80% del genoma.
El genoma humano es un texto masivo. Si los tres mil millones de pares de bases, que configuran todo el DNA humano en una célula fueran impresas en libros de teléfonos, el apilamiento que contuviera el genoma completo sería tan alto como el monumento a Washington.
Para obtener exactamente la secuencia de todas las bases los científicos necesitan leer las tres mil millones de bases no sólo una vez, sino por lo menos de 6 a 10 veces.

MAPEO (Construyendo mapas)

Antes de cortar el DNA y empezar a secuenciar, los investigadores del PGH elaboran un mapa del genoma. Encuentran millares de señales dispersas en los cromosomas que les ayudan a navegar a través del DNA. Desarrollar estos mapas es el primer paso a la hora de secuencir el DNA, siendo también, al ser tan detallados, una herramienta importante que orienta a los genéticos en la búsqueda de los genes de la enfermedad.
Con suficientes marcadores en cada lugar, los científicos crean librerías de copias, que reproducen esa parte del genoma. Cada uno de las copias contiene un pequeño fragmento manejable de DNA humano que es guardado en una bacteria. Los científicos pueden saber de qué parte del genoma humano deriva cada copia al saber qué marcador contiene.
Este mecanismo "copia por copia" para analizar el genoma hace posible la doble comprobación de las localizaciones de la secuencia. Y como el PGH es un esfuerzo internacional que se lleva a cabo en varios laboratorios, dividir el genoma ha permitido que diversos grupos coordinen su trabajo con eficacia.

Elaborando Bibliotecas

Las bibliotecas de copias ofrecen las ventajas de las verdaderas bibliotecas: acceso ordenado a la información. En la mayoría de bibliotecas de copias, los fragmentos de DNA humano se almacenan en la misma clase de bacteria,, Escherichia coli. Cada célula de E. coli ,en una biblioteca, almacena un solo segmento de DNA humano, para poder ser aislado y copiado fácilmente.

Subcopias

Para secuenciar el genoma, los científicos cortan copias relativamente grandes, llamadas BACs, de unas 100.000 a 200.000 bases de longitud, en fragmentos más pequeños de unas 2000 bases de largo, los cuales son guardados en virus de E. Coli. Estas copias más pequeñas son más manejables a la hora de realizar reacciones de secuenciación, permitiendo que los científicos determinen la secuencia de las copias grandes.

Almacenamiento de E. Coli

Las células de E. Coli que contienen fragmentos del DNA humano pueden almacenarse en frío indefinidamente. Cuando se necesitan para recuperar el DNA de la biblioteca, basta con calentarlas a 37 grados centígrados.
Para hacer muchas copias del DNA humano, las células de E. Coli actúan como copiadoras. Se las ponen en un medio de cultivo en un fermentador y se dividen rápidamente, obteniendo millones de copias del fragmento de DNA que contienen.

Preparando el DNA para secuenciar

Se rompen las células para obtener el fragmento de DNA de su interior. El DNA es separado del resto de la célula y se limpia. De esta forma obtenemos suficientes copias limpias del segmento de DNA humano necesario para iniciar una reacción de secuenciación.

REACCIONES DE SECUENCIACIÓN

Una reacción de secuenciación incluye 4 ingredientes principales: una plantilla de DNA copiada por la bacteria, bases libres, pedazos cortos de DNA, llamados primers; y la DNA polimerasa, la enzima que copia DNA.
La reacción química que tiene lugar en el tubo de ensayo es muy similar a la que ocurre en la célula: la nueva cadena crece desde la posición 5' a la 3', según el emparejamiento de bases. Las bases libres que complementan a la secuencia plantilla se unen al extremo cada vez mayor del nuevo filamento.
Entre todas las bases libres que están en disolución algunas tienen una porción química adicional. Se trata de un tinte fluorescente, que tiene un color distinto para cada base. Cuando las bases coloreadas atacan al nuevo filamento en crecimiento, se para el crecimiento de la cadena.

Productos de las reacciones de secuenciación

Una reacción de secuenciación completa da lugar a un arsenal de fragmentos coloreados de DNA. Los más cortos son de la longitud del prímer más una base coloreada. Los más largos están entre 500 y 800 bases de largo.
Estos fragmentos se introducen en una máquina de secuenciación automática. Estas máquinas han llegado a ser cada vez más sofisticadas durante la década pasada, procesando información más rápidamente y requiriendo menor tiempo su configuración.

Separando las reacciones de secuenciación


Las moléculas de DNA producidas en la reacción de secuenciación son separadas por un proceso llamado electroforesis. Las moléculas de DNA están cargadas negativamente, por lo que la secuenciadora crea un campo eléctrico que produce el movimiento del DNA a través de un gel poroso hacia las cargas positivas. Los fragmentos más pequeños se mueven más rápido a través de los poros del gel, que los fragmentos más grandes.

Leyendo los productos de secuenciación

En la secuenciadora, un láser excita al tinte fluorescente y una cámara detecta la luz que éste emite. Uno a uno, la secuenciadora lee las moléculas del DNA que han pasado por el gel, enviando la información a un ordenador.

Reuniendo los resultados

Un programa de ordenador ayuda a integrar la información de cada reacción de secuenciación individual. Marca los puntos donde los fragmentos se solapan, para juntar todas las piezas.
Muchas lecturas de secuencias solapadas son necesarias para revelar la ininterrumpida secuencia de la tira original de DNA. De media, cada par de base del DNA humano se secuencia 9 veces. Algunos segmentos de DNA son más fáciles de leer y necesitan ser secuenciados menos a la hora de conseguir una secuencia de alta calidad; otros necesitan ser analizados más exahustivamente para acabar con una secuencia de alta calidad.
Para secuenciar el genoma humano, los científicos han realizado más de 50 millones de reacciones, en total unos 2000 investigadores en más de 2 docenas de laboratorios repartidos por todo el mundo han trabajado hacia tan esperada meta.

SECUENCIA BORRADOR

Los científicos del proyecto han convenido, que siempre que consigan secuenciar una porción de DNA de 2000 o más bases, enviar los datos en le plazo de 24 horas a las bases de datos públicas, para que cualquier persona con acceso a Internet pueda ver y analizar la secuencia.
En la primavera de 2000, después de secuenciar los 3.000 millones de bases en el genoma humano en una media de cuatro veces, el PGH presentó la secuencia de DNA para el 90% del genoma humano. Esta secuencia borrador es en el 99.9% exacta.

Conclusión

Quedan algunos huecos y ambigüedades en la secuencia representativa del genoma, hasta que cada letra del DNA se haya secuenciado aproximadamente 9 veces. El borrador tiene la mitad de esa información, así que contiene huecos donde por casualidad la secuencia no ha sido obtenida. A veces las características químicas de algunos fragmentos de DNA impide su análisis. También hay muchas secuencias repetidas que complican montar con precisión la secuencia del genoma. Algunas repeticiones son cortas, otras largas; algunas presentes en millones de copias, otras repetidas un par de veces.
Antes de que la secuenciación del genoma humano se considere acabada, los científicos deben resolver todas las ambigüedades que puedan ser resueltas, hasta tener un error mínimo (no más de un error por 10.000 bases, la secuencia será 99.99 exacta). La secuenciacion del genoma por completo se espera para el año 2003.

© 2003 Vega, C.; Fersán, G.

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